- 首页 ＞ 免疫组库测序
免疫组库测序
??????? T/B细胞是适应性免疫系统的两大细胞群，细胞表面受体TCR/BCR存在一块区域叫互补决定区（Complementary Determining Region, CDR），包含CDR1、CDR2、CDR3，其中CDR3最高变，在抗原识别中起关键作用。华大的免疫组库测序是通过多重PCR和高通量测序技术，分析编码CDR3区的DNA/RNA序列，获得∞机体的免疫特征。
图1 免疫组库图解
产品优势
一站式服务：提供从CDR3的扩增、建库、测序、后续信息分析以及数据挖掘一系列全方位◇的服务；
有针对性的研究ζ 方法：针对CDR3的V区及J区两端设计引物，目的扩增CDR3区域；
扩增偏好性↑低：采用两步法建库，并优化引物配比，将扩增偏好性降低约70%；
可重复性高：同一样本建库两次克隆一致性高；
图2? 同一样本实验重复¤性评估(Hiseq)
更丰富的○分析结果：新增多种结果统计图表；新增V/J基因频率分布统计、多样品聚类分析、共性分析、差异分析；新增四种多样性评估指标；
更友好的xbio结※题报告展现形式：全新升级的结题报告界面友好，对分析方法及结果解释详尽，图表按照发表文章要求展示，让您一目了然；
更真实的克隆定量信息：将低质量reads与高质量克隆进行比对，挽回重要数据∏，让克隆定量信息不丢失；
更⊙强的纠错能力和错配处理能力：利用多层聚类方法，纠正PCR和测序引入的错误；错配处理能力提升，更适合分析BCR的高突变区域。
?
?产品应用
?
?
服务内容
|
目的链 |
目标区域 |
样品类型 |
扩增方法 |
测序策略 |
|
TCRα 或 TCRβ |
CDR3 |
DNA 或 RNA |
M-PCR (VJ) |
PE150 |
|
BCRH 或 BCRL |
CDR3 |
DNA 或 RNA |
M-PCR (VJ) |
PE150 |
|
BCRH (鉴定抗体亚型▆) |
CDR3 |
RNA |
M-PCR (VC) |
PE150 |
?
信息分析内容
1、基本数据统计?
???? 数据过滤，对原始数据进行去除接头污染及低质量reads的处理
???? 数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效数据构建
???? 数据统计，数据产出统计及测序数据的成分和质量评估
2、数据比对╲分析
? ???比对分析，与数据库V/D/J基因片段比对
???? 比对结果统计
3、克隆序列特征注释
??? CDR3区核酸序列和氨基酸序列
??? 鉴定无效序列（包含终止密码子，超出结构范围）
??? 鉴定单※碱基突变（替换、删除、插入）（for BCR）
4、单样品克№隆群体特征分析
?? ?CDR3序列长度分布
??? V/J基因频率分布
??? V-J基因组合频率分布（3D, Circos）
?? 克隆群体结构分析（频率分布，D50曲线，甜甜圈图）
5、样品间比较分析?
??? 测序卐饱和度分析
??? 克隆多样性分析(辛普〗森系数、香农威※纳系数等)
??? 样品间共有克隆分析
??? 聚类分析（层次聚类，MDS聚类）
??? 组间差异分析
肿瘤案例： TCR克隆异质性与新抗原异质性及肺癌复发的关系
Cancer Discovery. 2017 Oct;7(10):1088-1097.
研究目的：寻找∑ 免疫检查点（PD-1、CTLA-4）治疗疗效的↑biomarker
研究样本：11例未转移肺腺癌，共45 tumor regions (2 to 5 regions per tumor)
研究技术：WES、TCR sequencing
研究结果：病灶特有突变导致新抗⌒ 原（neoantigen）的内部表达差异，因此，产生不同的免疫原性，形成了TIL克隆内部差异（TCR ITH）。TCR ITH（intratumor heterogeneity）高与术后疾病复发和低生存率有关。?
?
图1 TCR克隆异质性（ITH）与肺腺癌基因组和临床的相关▼性
（A）年龄与MOI相关性；（B）新抗原与MOI负相关；（C）复发的病人具有更高的TCR ITH（lower MOI）；（D）MOI越高（TCR克隆多样性越低），病人的无病生存期（disease-free survival）越长。MOI：克隆重叠指数，范围0-1，0代表克隆完全不同，1代表克隆完全相同。
?
感染类疾病案例：TCRβ序列特征可准确预测CMV感染状态
Nature Genetics. 2017, 49(5): 659-665.
研究目的：确定是否可以用TCR特征预测CMV（巨细胞病毒）感染状态。
研究样本：群体1：共计666个样本，其中289个CMV阳性，352个CMV阴性，40个感染状态未知；群体2：120个验证样本。
研究结果：对289个CMV+和352个CMV-样本进⊙行免疫组库测序，发现了CMV相关的TCRβ序列特征，并且利用TCRβ可以从666个研究样本和120个验证样本中，准确鉴定出CMV感染状态。研究还发现该群体的TCRβ与HLA-A或HLA-B显著相关。
图2 TCRβ可预测CMV感染状态
（a）CMV+和CMV-样本中unique TCRβ分布散点图。（b）ROC曲线显示TCRβ作为CMV感染状态分类器的分类效果。其中虚线表示在群体1中的测试结果，短虚线代表群体1中的交叉验证效果，实线代表群体2中独立验证效果。每条线上的黑圈代表最大后验概率（MAP）的决定阈值。插入图表展示的是【群体2中MAP分类效果，敏感度为0.90，特异性为0.89。
?
自身免疫性疾病案例：杀伤T细胞的突变积累可能与类风湿性关节炎发病有关
Nature Communications. 2017, 8:15869.
研究目的：大颗粒淋巴细胞白血病（LGL）常合并发生类风湿性关节炎（RA），研究发现LGL病人的CD8+ T细胞克隆存在STAT3突变，而拥有该突变的LGL病人更容『易并发RA（43% vs. 6%）。因此推测，发生体细胞突变的CD8+ T细胞可〗能与RA发病有关。
研究样本：82例新诊断未治疗◥的RA病人，20例健康人，取外周血。
研究结果：首次采用CD4+ T细胞做对照，过滤生殖系突变（germline mutations），对分选的T细胞进行目■标区域测序、外显子测序和TCR β链CDR3测序。发现，大约20%（5/25）病人的CD8+ T细胞有体细胞突变（somatic mutations），而CD4+ T细胞没有，RNA-seq确认了突变基▽因在CD8+ T细胞中高表达。功能分析发现，这些基因突变与免疫调控、细胞增殖有关，因此推测，发生体细胞突变的CD8+ T细胞可能与RA及其他自身免疫←性疾病的发病有关。
?
图3 病人1中CD8+ T细胞的克隆≡分布及突变
（a）利用TCR测序获得的CD8+ T细胞克隆分布。（b）病人1中存在两个高频克隆，经过免疫抑制治疗后仍高表达。（c）利用扩增子测序，在流式分选后的亚群中进行突变验证。（d）本文研△究思路图。
?
华大基因已发表IR-seq相关文章
|
研究内容 |
发表时间 |
发表期刊 |
影响因子 |
文献标题 |
|
肝癌亚型差异分析 |
2015.04 |
Oncoimmunology |
7.72 |
Identification of characteristic TRB V usage in
HBVassociated HCC by using differential expression profiling analysis |
|
分析软件 |
2015.08 |
Genetics |
4.56 |
IMonitor: a robust pipeline for TCR and BCR repertoire
analysis |
|
骆驼 |
2016.09 |
PLoS One |
2.81 |
Comparative Analysis of Immune Repertoires between
Bactrian Camel's Conventional and Heavy-Chain Antibodies |
|
实验方法学 |
2016.03 |
PLoS One |
2.81 |
Systematic Comparative Evaluation of Methods for
Investigating the TCRβ Repertoire. |
|
肝癌 |
2015.07 |
Cancer Letters |
6.38 |
Immune repertoire: A potential biomarker and
therapeutic for hepatocellular carcinoma |
|
原发性胆汁性胆管炎 |
2016.09 |
Journal of immunology |
4.86 |
Clonal Characteristics of Circulating B Lymphocyte
Repertoire in Primary Biliary Cholangitis |
|
微小残留病 |
2016.10 |
Frontiers in Immunology |
6.43 |
Minimal Residual Disease Detection and Evolved IGH
Clones Analysis in Acute B Lymphoblastic Leukemia Using IGH Deep Sequencing |
|
预测V/J基因软件 |
2016.11 |
Frontiers in Immunology |
6.43 |
IMPre: An Accurate and Efficient Software for
Prediction of T- and B-Cell Receptor Germline Genes and Alleles from
Rearranged Repertoire Data |
|
乳腺癌、癌◎旁和淋巴结的TCR分析 |
2017.02 |
Cancer Immunology Research |
8.28 |
The Different T-cell Receptor Repertoires in Breast
Cancer Tumors, Draining Lymph Nodes, and Adjacent Tissues |
|
结肠腺瘤和结肠癌浸润淋巴细胞 |
2017.05 |
Journal of immunology |
4.86 |
Characterization of the B Cell Receptor Repertoire in
the Intestinal Mucosa and of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Colorectal
Adenoma and Carcinoma |
|
免疫缺陷 |
2015.12 |
Human Molecular Genetics |
5.99 |
DCLRE1C (ARTEMIS) mutations causing phenotypes ranging
from atypical severe combined immunodeficiency to mere antibody deficiency |
|
肾移植 |
2016.11 |
Transplant Immunology |
1.32 |
T cell repertoire following kidney transplantation revealed by high-throughput sequencing |
图1 克隆群体特征分析
A，V-J基因组合频率Circos图，每个颜色块代表一种基因，颜色块越宽，频率越高。色块间的连线代表一种V-J基因组合方式。B，克＠隆频率分布，横纵坐标分别为克隆数和◥克隆频率。C，克隆频率分布甜甜圈图。第一层为1个reads、2个reads及≥3 reads支持的克隆类型比例；第二层为≥3 reads支持的克隆类型中，top 20%、20%-40%、40%-60%、60%-80%、80%-100%克隆的累积频率分布；第三层为top5克隆类型的频率分布及对应的氨基酸序列。D，Top20 V基因频率组间分布柱状图。
表1 免疫组库DNA/RNA送样建议
|
样本类型 |
总量 |
浓度 |
RIN |
28S/18S |
基线和5S |
纯度 |
|
Sorted
T cells RNA / PBMCs RNA |
≥500ng |
≥35ng/μL |
RIN≥7.0 |
28S/18S≥1.0 |
基线平整，5S峰正常 |
无DNA，蛋白/盐离子♂等污染，样本无色透明不粘稠 |
|
Whole
blood RNA/ Tissue RNA |
≥1μg |
≥70ng/μL |
RIN≥7.0 |
28S/18S≥1.0 |
表2 免疫组库组织送样建议
|
组织类型 |
提取DNA建议送样量 |
提取RNA建议送样量 |
|
分选细胞 |
≥1×106 |
≥2×105 |
|
新鲜动物组织干重 |
≥200mg |
≥30mg |
|
全血 |
≥2mL |
≥ 1 mL全血收集的淋巴细胞or ≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect? Animal Blood Tubes收集◥的全血 |
注意：对于组织样品，若淋巴细胞含量低，存在扩增不出来的状况。
Q1： TCR和BCR各条链编码基因的区别？推荐哪条链？
TCR Beta链和BCR重链是由V、D、J基因≡编码的，而TCR alpha链和BCR轻链是由V、J基因编码的▽。从发表文章来看↘，研究TCR beta链和BCR重链的比较多。
Q2：免疫组库测序可以区分IgG、IgM、IgD、IgE吗？
免疫球蛋白的亚型，通过C区序列可以区←分，华大有相应的引●物，但必须是RNA样品。利用多重PCR的方法，利用V区-C区的引物，用约30bp的序列区分。产物长度大∑约是在》200-300bp。
Q3：免疫组库的测序深度？能得到多少序列？
分析数据显示，数据量的增加，主要影响低频克隆，并且这些克隆的排序在一千多◢到九千不等，而研究往往只关注top100的克隆和疾病的关系，所以推荐起始数据量1G raw data。但如果客户想关注更多低频克隆，可以加大测序数据量。
Q4：做免疫组╳库测序，用基因组DNA做模板好，还是RNA好？
DNA水平侧重于研究基因重组信息，RNA水平侧重于研究基因的表达状态。使用DNA和RNA做模板●各有优缺点:
gDNA的优点是：
1）因为每个基因只有两个拷贝，因此可准确地反映免疫细胞受体的克隆数；
2）DNA更稳定，易储存。
缺点是：
1）由于copy数不高，模板含量低，因此可『能需要更多的样品；
2）由于J区和C区之间有很大的intron区，受测序♂长度的局限，缺少特●异性扩增引物来扩增CDR全长。
RNA的优点是：
1）J区和C区之间无intron，可用C区进行引物设计，扩增全长CDR；
2）由于表达丰富，模板含量高，样品消耗量少。
缺点是：
1）免疫细★胞受体的克隆性受到mRNA表达高低的影响，不能客观地反应本身的克隆数；
2）RNA不如DNA稳定，样品保『存和操作要求较高。
