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脂质组学
脂质组学是对生物体内的脂质进行系统分析的一门新兴学科, 是代〖谢组学的重要分支。基于液质联用技术（LC-MS），无偏向性、尽可能多地检测细胞、组织、器官或体液等生物样本内所有的脂质分子，对实验组和对◣照组进行对比分析，通过＠ 统计分析筛选差异脂质分子， 进而寻找脂质代谢变化与生理病理变化的相对关系，揭示脂质在各种生命活动中的作用机制。
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技术优势
1.? ?脂质分子鉴定准确度高
比对二级质谱图鉴定，鉴定数1000左右，进行脂质◢大类、亚类、种属、分子多ω层次分析
2.? ?超高分辨率质谱☆平台
使用QE系列谱仪进行检测，仪器分辨率高、质量精度高、稳定性好
3.? ?规范化平台严格质控
全流程标准操①作程序（SOP）指导，同位素内标与QC双重质控
4.? ?大样本项ω 目经验丰富
高通量自动化样本制备系统进行代谢物提取，实时监控仪器检测过程
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产品应用
1.? 脂质的鉴定与功能研究
2.? 脂质生→物标志物发掘
3.? 脂质代谢途径和网络研究※
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技术路线
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技术参数
1.??仪器平台
LC-MS/MS：液相-Waters?ACQUITY?UPLC，质谱-Thermo?Q?Exactive?/?Q?Exactive?HF?/?Q?Exactive?HF-X
2.??分析软件
LipidSearch（Thermo,?USA），metaX?(华大自主开发♀的代谢组学分析软件包)
3.??数据库
LipidSearch配套数据库，脂质组数据库，包含一级质谱和二级质谱信息，覆盖8大类脂质、300种脂质↑亚类，包含超过170万个脂质离子及其预测碎片离子的信息
项目周期
30-60个自然日
案例一： 首个中国人群糖尿病非靶向血浆脂质组研究（华大合作】发表）[1]
研究背景：
血脂异常和II型糖尿病（T2D）之间的联系已经被广泛报道，但II型糖尿病发展过程中的脂质全谱变化，尤其是在东亚人群中的特↙点，并未完全阐」述清楚。通过研究中国II型糖尿病患者、糖尿病前期与糖耐受正常人群的血浆脂质代谢物组成及差异，可为亚洲人群的脂代谢研究提供参考。
实验设计：
样品：293个中国人的血」浆样本，其中有114位II型糖尿病（T2D）患者，81位早期糖尿病患者（prediabetic），98位血糖█正常的人（NGT）
研究方法：基于LC-MS/MS技术的脂质组学
实验结果：
脂质组检测共获得11,077 个特征峰，其中约46.77%可以匹配到一或多个脂质分子或脂类化合物。通过PERMANOVA 发现，脂质组数据和几个血浆参数以①及生理情况密◣切相关。
共有1590 个峰在三个实验组中有显著差异，790 个可能匹配上脂质分子或脂类化合物。成对比较揭示出1269 个特征峰在NGT 和T2D 之间有显著差①异，prediabetic 与NGT 和T2D 比较，分别有785 和578 个特征ω峰有显著差异，暗示着与NGT 相比，prediabetes 和T2D 拥有更为相似的脂质组。这些结果显示，从NGT 到prediabetes 再到T2D，代谢物会发生持续地变化。
图1-2 三组两两比较显著差异脂质的韦恩图；基于脂质全谱的随机树分类
主要结论：
1. 脂质组数据和几个◤血浆参数以及生理情况密切相关
2. 从NGT到prediabetes再到T2D，脂质会发生持续地变化
3. 成功构建28个特征峰模型，用于指示T2D的发生发展。AUC=90.23%
4. 揭示脂质分子和糖尿病的临床指标之间的∴相关性
案例二：脂质组学介导植物乙烯通路水解酶MHZ11功能的研◆究[2]
研究背景：
作为重要的植物激素，乙烯参与调节植物的生长、发育、应激反应等重要的生理过程。在拟南芥中，乙烯信号通路已经被揭示——乙烯和√固定在内质网膜上的乙烯受体结合后，使受体转为非活性态，不能激活下游的CTR1，使得EIN2去磷酸化从而激活乙烯信号转导通路。但是在水稻中具体CTR1是如⌒ 何调节乙烯信号通路的仍有待发现。
技术路线：
作者发现了一个水∑ 稻突变株mhz，其根部乙烯信号通路受到阻滞，随后通过分子生物学实验及脂质组学对关键蛋白MHZ11的底物及其参与到乙烯信号调节通路的调控规律进行研究。
主要结论：
1. 水稻突变株mhz11显示出根部对乙烯不敏感的特异性表型，基因分析发现其MHZ11基因发生，MHZ11作为正调控因子参与到水稻根部的乙烯信号调节通路中。
2. MHZ11是一个没有特异性的脂肪酶，通过脂质组学分析发现MHZ11可能参与磷脂的水解生成FFA，FFA可参▼与后续酯类的合成。
图3 水稻（野生型WT，突变株mhz11，MHZ11过表达株OE-4）根部的脂质表达统计图
3. MHZ11具有水解酶的活性，能够通过水解磷脂生成lyso-PE，FFA后与甾醇反应生成甾醇酯，膜表面甾醇含量的减少影〖响到乙烯受体及OsCTR1的相互作用，从而介导了下游乙烯信号通路的激活。
图4 MHZ11参与乙烯通路可能的过程图
参考文献
[1] Zhong, Huanzi, et al. "Lipidomic profiling reveals distinct differences in plasma lipid composition in healthy, prediabetic, and type 2 diabetic individuals." Gigascience 6.7 (2017): gix036.
[2] Zhao, He, et al. "The GDSL lipase MHZ11 modulates ethylene signaling in rice roots." The Plant Cell 32.5 (2020): 1626-1643.
1、数据预处理及质控分析
使用LipidSearch 软件进行LC-MS/MS数据处理，包括智能峰提取、脂质鉴定、峰对齐等的一系列分析。LipidSearch导出的数据通过metaX进行数据预】处理、质控分析⊙和后续分析。数据质控的内容包括，QC样本的BPC重叠图、所有样本的PCA分析、各组的CV分析。
图1 数据质控分析
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2、鉴定及定ぷ量结果展示
（1）脂质分子数和亚类数的鉴定概况
国际脂质分类和命名委员会(International Lipid Classification and Nomenclature Committee)将脂类化合物分为八大类别(Category),每个类别又分为不同的大类（Main Class）,每个大类可以根据极性头基的不同分为不同的亚类(Sub Class),每一亚类根据碳链不饱◤和度或长度等的√差异分为不同的分子种属(Molecular Specie),每个分子种属对应多个不同的脂质分子（Lipid Molecule），构成脂类化合物的五级分类。对数据预处理后的脂质分子数量和亚类数量进行统计。
表1 脂质分子数量统计表
|
Lipid_Molecules_Number |
Sub_Classes_Number |
|
1208 |
36 |
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（2）脂质亚类的鉴定及定量分析
图2 脂质亚类的鉴定和定量分析
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3、差异脂质分子的筛选
通过PCA分析观察了解两组样本的差异情况。采用多变量▆分析PLS-DA模型前两个主成分的VIP值，结合单变量分析差异变化倍数（Fold Change, FC)）和T检验(Student's t-test）的q-value值来筛选差异表达的■脂质分子。筛选条件: 1）VIP ≥ 1；2） Fold-Change ≥1.2 或者 ≤ 0.8333；3） q-value < 0.05，同时满足这三个条件，即为差异脂质分子。
图3 差异脂质分子的筛选
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4、差异脂质分析
包括差异脂质分子的〗聚类热图分析和差异脂质分子的相关性分析。
图4 差异脂质分子的分析
1、 重复次数要求
每组样本的生物学重复次数要求如下，重复□ 次数越多越好。
表1 生物学重复次数要求
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样本类型 |
重复次数要求 |
|
植物、微生物、细胞样本 |
≥ 6个 |
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动物样本 |
≥ 10个 |
|
临床样本 |
≥ 30个 |
2、 送样量要求
表2 送样量要求
|
样本类型 |
建议送样量/例 |
|
血清、血浆 |
≥ 250 μL |
|
尿液 |
≥ 500 μL |
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动物及临床组织 |
≥ 200 mg |
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粪便、肠道内容物 |
≥ 200 mg |
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细胞 |
≥ 107个 |
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微生物 |
≥ 107个或≥ 100 mg |
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培养液、发酵液 |
≥ 1 mL |
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植物组织 |
≥ 1g |
Q1：为什么要使用质谱正负离子模式◎同时采集的方式＠进行分析？
A1: 不同的脂质在正（负）离子模式下电离的程度不同，如PC在正离子模式下更容易电离，而PE在负离子模式下更容易¤电离，同时采用正负离子模式对脂质组学进行数据采集，可以扩大脂质的覆盖＠度。
Q2：为什么要进行生ξ 物学重复？
A2：样本量少得到的结果个体差异可能会超越组间差异，使得结果可信度不高，甚至可能无法筛选出差异脂质 。因此对于不同的样本类型有不同的生物学重复次数要求。
