- 首页 ＞ 单细胞全基因组甲基化测序
单细胞全基因组甲基化测序
单细胞全基因组甲基化研究概述
DNA的甲基☉化是在DNA甲基转移酶的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成 5-胞嘧啶的△过程，刚被发现时被定义为第▆5种碱基，实际上它是一种非常关键的表观遗传学标签，对于调控和维持不同细胞类型的转录程序起到极其重要的作用。
同一个生物个体内几乎所有不同类型的细胞都拥有几乎完全相同序↘列的基因组DNA，相同序列的 DNA 分子可以有大量不同的甲基化修饰状态，正是这些甲基化修饰状态的不同，使得每种类型的细胞，甚至是每个细胞都有自己特定的基因表达№特点∩。这些不同的修饰以及修饰的组合，使得不同种类的细胞，或者同种细胞类型不同细胞间产生异质性。这种单细胞水平的细胞类型特异的基因组甲基化◢修饰状态，是表观遗传学领域的重要研究方向。
研究流程
技术优势
- 首先对细胞进行BS处理，再加接头扩增，尽可能减少单细胞内DNA甲基化ζ修饰的损失。
- 在随机引物扩增过程加接头，减少操作步骤、降低DNA损耗。
信息分析内容
1. 去接头污染、低质量的reads，并统计♂数据产出量及测序质量；
2. 将Clean Data中的reads比对到ref基因组，并统计比对率、duplication rate、Insert Size分布及ω 平均测序深度；
3. 全基因组C位点的甲基化信息计算，并统计BS转化率及C位点的深度-覆盖度；
4. CGI、promoter区域的C位点覆盖度；
5. 甲基化水平的分』布：
a) 多样本时，各样本全基因组上的整体平均甲基化率的分布；
b) 全基因组（n kb窗口）的甲基化水平的分◥布及图形展示；
c) 各样本中，几类gene区域中，甲基化状态分布的趋势；
6. 甲基化/非甲基化 位点个数⊙的统计，及它们在各gene元件上的个数分布；
7. 甲基化/非甲基化 区域的计算；
8. CGI的甲基化状态的展示：
a) 甲基化的、非甲基化的、中间甲基化状态的CGI的个数分布；
b) CGI平均甲基化率的分布；
9. 多样本时，样品聚类；
10. 多样本时，同质性/异质性的分析；
a) CpG位点甲基化状态的一致性计算；
b) CGI区域㊣ 甲基化状态的一致性计算；
c) 样本间n kb窗口的甲基化水平的相关性；
11. Group间DMR区域的计▆算及注释。
单细胞全基因组甲基化测序揭示鼠肝甲基化组的强烈异质性
Single-cell genome-wide bisulfite sequencing uncovers extensive heterogeneity in the mouse liver methylome
研究概述：
通过对21个肝脏细胞和5个胚胎成纤维细胞进行全基↓因组甲基化测序，分析其全基因组5mC甲基化图谱，结果发现鼠肝脏细胞甲基化可变性非常高，并具有高度的异质性；其中包含H3K4mel的区域可变性非①常高，promoters和CpG islands非常稳定。同时，文章发现不同基因组特点的5mC甲基化异质性也有所』差异；其中非功能位点，如重复序列、内含子区域很不稳定；潜在的功能区位点，如：promoters区域较为稳定。
结果展示：
1. 单细胞全基因组甲基化的genome-wide 5mC分析结果展示：
2. 5mC 异质性分析结果展示：
图1 500bp窗口下的CpGs水平分析
图2 所有样本甲基化水平相关性分析
图3 样本聚类分析
图4 甲基化CGIs重复性分析
图5 gDMR组间甲基化差异程度分布
图6 DMR相关基因的GO聚类分析
样品要求：
- 裂解好的单细胞：细胞数目为实际数目的两倍※（如客户计划做5个细胞，应该至少送10个细胞）；
- 细胞培养物（细胞系、原代培养细胞等）：完整且有活性的细胞数量不少2x105
个；
- 新鲜组织：组织尺寸不小于▼1cm3?或者消化后细胞数目不少于1x107?个（BGI
仅提供通用组织消化方法，不同组织消化条件略有不同，需要自行测试）。
- 血液：不少于5ml EDTA 抗凝血。
Q1：单细胞全基】因组甲基化测序大致流程如何？
单细胞分离（口吸管法）→单细胞裂←解→Bisulfite转化→Index建库&PCR→文库质检→上机测序→信息分析→结果交付。
Q2：单细胞全基因组甲基化测序建议测多深的覆盖度？
对单细胞样品来说，建议测序深度4X-5X即可。实验＠ 数据表明，单个细胞在clean data为3X数据量的情况下，其CpGs的覆盖度为20%，并趋于饱和态。
?Q3：单细胞全基因组甲基化的技术稳定性及重复性如何？
测评数据表明，使用单细胞全基因组甲基化建库方法进行建库测序的多细胞（Bulk）样品CpG位点〓一致性可达79.52%，说明该方法的稳定性及重复性︻较好。
图1 500bp窗口下的CpGs水平分析
Bulk为多细胞样本，CpG位点的一致性为：79.52%。其中包含了4个样本：Bulk1(5ug)，Bulk2(50ng)，Bulk3(50pg)，Bulk4(15pg)。
YHsc为单细胞样本，单细胞文库间的相关性较多细胞（Bulk）样本差，分别为62.34%，说明单细胞间的异质性是比较明显的。
