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单细胞重测序
单细胞研究概述
目前测序∮技术已经深入到人类疾病健康、物种进化、动植物分子育种等传统的生物学研究领域中，逐渐成为一种不可或缺的研究工具。然而随着生命科学和医学基础研究的深入发展，人们发现越来越多的特殊标々本和特定的生物学现象，如法医鉴定的微量标本、肿瘤内部△异质性等无法用常规组织测序的方法☉进行研究。为了更好的处理这些标本和研究这类现象背后的机理，科学家经过不懈的努力，从而产生了单细胞扩增和】分析技术。单细胞技术在人类疾病健康研究的应用将更好地揭●示它们的发生发展过程和规律, 从而有助于人类疾病的认识、预防、诊断和╲治疗。
研究流程
图1 单细胞DNA技术♀研究流程图
单细胞DNA扩增技术比较
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MALBAC |
MDA |
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扩增的DNA长度 |
0.5-1.5kbp |
2-100kbp |
|
人工序列引入 （Induced
artificial sequence） |
70bp = 35bpx2 (作为引物 => ~7% 数据浪费) |
不存在 |
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覆盖度 (>25X时) |
84%~93% |
>95% |
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假阳性率 |
4X10^-5 |
1X10^ |
对于MDA和MALBAC两种技术，我们检测了低深度下的数︽据质量。如下是我们⊙测试的结果：
|
单细胞1* (MDA) |
单细胞2* (MALBAC) |
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|
比对率(%) |
92.81 |
88.45 |
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全基因组覆盖度(%) |
7.935 |
7.09 |
*样品选择：第一〒例亚洲人基因组供体（炎黄）的类淋巴母细胞细胞系的单细胞；
*数据设置：分别用MDA和MALBAC技术对两个重复做0.1X深度的扩增;
从结果可以看出，低深度数据下，MDA的Mapping率和覆盖度都优于MALBAC方法法。我们的MDA方法的数据有效性也∩略优于MALBAC（reads会截取35bp的数据浪费）方法。高深度的测序（MDA技术）非常适合SNV检测。
文库卐及测序策略
文库构建策略： 根据研究目的构建人重、外显子、目标区域文库
测序策略：DNBSEQ平台 PE150
推荐数◣据量：
针对大批量细胞的测序，可以进行低深度潜覆盖测序；对于细胞之间亲缘关系◆较大的，可以适量增加测序深度。
针对小规模细胞测序，研究功能性变化的，可参考常规全基因组重测序/外显子组测◣序/目标区域测序的测序深度。
其余¤个性化研究目的，测序深度视不同的研究目的可适度调整。
信息分析内容(建议30X以上覆╳盖深度)
- 去除接头污染序列及低质量数据
- 比对，产出数据统计
- SNP检测、注释和统↘计
- InDel检测、注释和ξ统计
- SV检测、注释和统计（仅全基Ψ 因组测序）
单细胞测序发现一例结肠癌为双克隆起源，不同克隆展现不同的突变特征
Discovery?of?biclonal?origin?and?a?novel?oncogene?SLC12A5?in?colon?cancer?by?single-cell?sequencing
案例描述：
? ? ? ?深圳华大基因研究院联合香港中文大学合作、北京大学肿瘤医院/研究所的研↙究人员，对一例T3N0M0结肠癌病人的63个肿瘤单细胞、4个正常单细胞样本进行外】显子测序∞。单细胞群体遗传学分析发现肿瘤细胞群体存在两个克隆群体，不同克隆具有不同的▽突变特征。
部分研究成果：
? ? ? ?群体遗传学分析发现该例肿瘤为双克隆起源。其主要克隆群体发生了APC、TP53突变，次要克隆」群体CDC27和PABPC1为主々要突变，但APC和TP53未发生突变。
? ? ? ? 单细胞水平发现SLC12A5为高频突变，但群体水平突变率极低。功能验证「发现SLC12A5可能对结㊣ 肠癌具有致癌效应。
图1 结肠癌单细胞不同克隆群体的driver event分析
? ? ? ? 对结肠癌单细◇胞及另外21例结肠癌的变异结果进行分层聚类，发现major clone (red)主要包含TP53和APC，而minor clone (blue)主要包含CDC27和PABPC1，normal cells (green)不含突变。
图2? 突变图谱及dirver genes预测
(A) major clone中体细胞突变。左侧代表突变频率，右侧︽表示预测的driver genes Q-score; (B) 21例结肠癌的体细胞突变图谱，尖峰高度代表突变频率; (C) 结肠癌单细胞的突变图谱。
图1? 同义和非同义snp统计图
图2? 基因组和编码区域InDels分布图
图3? 存在结构变异的read对
图4? 变异在基因组上分布统计
图5? 变异基因通路代谢图
样品要求
主要针对人和小鼠样∞品。若为〓其他物种，需要客户提供看家基因检测引物。
样品准备
1)??????? 将细胞分选至装◣有3～5μL PBS缓冲液的200μL PCR管中，细胞数∩目不得超过1000个。不建议另外加入其他细胞保护剂，如有特殊☆情况，加入其他试剂或者经过其他处理,请在样品信息单中备注。
2)??????? 细胞分离完成后，请于10分钟内∴放入-80℃冰箱▅或者干冰保存。也可暂存于-20℃，但保存时间不得超ζ过3小时。
3)??????? 每个细胞样品建议送4管重复，以保证后续实验成功率。例如：需测序某一细※胞样品数为5个，则建议送样细胞样品管数为20。
4)??????? 除提供细胞样品外，还需要每批次提供一个阴性对照，即在PBS缓冲液→中加入0.1~0.5 μL的1% PBS-BSA溶液（分选细胞∞时，细胞所处保存溶液）。
表1 单细胞DNA测序⌒送样要求
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测序类型 样品类型 |
WGS |
WES/目标区域测序 |
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单细胞 |
1-2个（4μL
PBS悬液） |
1-2个（4μL
PBS悬液） |
|
微量细胞 |
2≤X≤1000（4μL
PBS悬液） |
2≤X≤1000（4μL
PBS悬液） |
注：X为细胞数目
?
Q1：单细胞重测序∏大致流程如何？
单⌒ 细胞分离（口吸管法）→单细胞裂→解提取DNA→单细胞全基因组扩增→建库测序→信息分析。
Q2：单细胞※分离方法有哪些？
单细胞分离主要有四种方法：激光显微切割、流式㊣ 细胞仪分选、微流控芯片分选和口吸管法分离。流式细胞仪需要对细胞进行染色和处理，可能影响全基因组扩增效果。目前华大采用的是口吸管▼法分离，该方法很大限度地Ψ避免了细胞损坏，还原细胞较真实的状态。华大在单细胞分离扩增经验非常丰富，现在已经完成了上万个细胞的分离与扩增。
Q3：单细胞是由客户还是华大分离？
推荐客户送分离好的⌒单细胞，并溶解在华大提供的裂解液当中。
Q4：单细胞肿瘤研究如何避免癌细胞取样的假阳性？
华大对单细胞不经过任㊣何染色，在显微镜下无法识别细胞是肿瘤细胞还是正常细胞，建议客户取样前通过病理〓学的方法估∏计肿瘤组织的纯度，我们一般要求纯度高于80%。虽然后期信息分析能排除◤肿瘤组织中正ξ 常细胞的干扰，但是肿瘤细胞含量较低需要选取的细胞总量ζ 将会增多，这会加大项目投入。
Q5：经过全基因组扩增之后可以得到多少基因组 DNA ？
全基因组扩增后可以得到3-5μg的DNA量，达到一般↓建库测序的DNA量要求，可用于各种常规的◣重测序。
Q6：单细胞扩增实验的成功率如何？
受样品质量或ω细胞状态的影响，可能造成全基因组扩增实验失败。根据实验的经验，现在我们的∴扩增成功率大概在50%，因此每例样品实际扩增的细胞数量需为测序↓细胞数量的2倍以上，例如项目设计方案确定对该样品的50个①单细胞进行测序和分析，则至少需ω提供100个细胞。
Q7：华大对扩增产物质控指标如何？
全基因组扩增中扩增不均会导致测▓序覆盖度低，为确保数据利用率，全基因组扩增实验后须对扩增产☉物进行质控。我们通过PCR方法对管家基因》进行检测。检测结∞果必须保证8个管家基因有6个◆以上阳性，反之则属不合格样品不能用于建库测序。现阶段管家基因质控的指标仅限于人，其他物种的还需要开发。此外我们还参考一般的卐DNA重测序送样要求对扩增产物进行质控。
Q8：华大采用的全基因组扩∴增技术如何？
单细胞扩增主要有两种◣类型的技术：基于热循环以PCR为基础的扩增技术↑,如简并寡核苷▅酸引物PCR (Degenerate oligonucleotide primer PCR, DOP-PCR)、连接反应介导的PCR (ligation mediated PCR, LM-PCR)、扩增前引物延伸反应 (Primer extension preamplification, PEP)等；基于等ㄨ温反应不以PCR为基础的扩增技术，如多重置换扩增 (Multiple displacement amplification, MDA)、基于引物酶『的扩增 (Primase-based whole genome amplification, pWGA)。前者以DOP-PCR为代表，具有扩增均≡一性较高的优点，不足之处是扩增覆盖度较低。后者以MDA为代表，该技术基于phi29酶在恒温①条件下进行扩增。该酶对于模板有很强的结合能』力，能连续扩增10Kb?的DNA片段而不从模板上解离，同时这种酶」具有3’→5’外切酶活性，错误ω 率仅为5 x 10-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以保证扩增的高保真性。华大单细胞全基因组扩增基于MDA技术，具有扩增产物长（大于10kb），覆盖度高（一般不低于☆70%，可达90%以上），扩增错误∏率低（仅为10-6），具有高特异性和灵敏性的特点。
Q9：MDA扩增的特点如何？
MDA具有扩增产物长、覆盖度高、扩增错误∑ 率低的优点，此外还存在两个主要的不○足：扩增均匀性和等位基因丢失。基因组上GC含量越★高扩增效率越高，导致高GC含量的区域测序深度远高于其他地方，呈现出明显的扩增偏向〖性。除了存在△扩增偏向性之外，在扩增过程中还存在等位基因丢失的问题（Allele dropout ,ADO，单细胞基因组上杂合︾的等位基因在扩增过程中会只扩增出其中一个等位基因，导致另外一个等位基因丢失的现象）。针对这些问题华大♀升级了扩增的方法，使得基因组上均一♀性比之前有了很大的提高；并且ADO也从之前Cell文章外①显子数据的平均43%降低到5%以下(小试数据)，大大降低了偏向性和ADO对下游信息分ξ 析的影响。（详细信息请看新方法测评结果）。
Q10：单细胞DNA测序可以做哪些变异检测？
单细胞经过全基因组¤扩增之后合格的扩增产物可以进行全基因组▲测序、外显子测序、目标区域捕ぷ获测序。不同的测序类型可以进行不同类型的变异检测◣，外显子测序和目标区域捕获测序只能进行SNP和Indel的检测；全基因组测序则能进行所有类型的变异检测，如SNP、Indel、CNV、SV，全面地反馈单细胞水平上的所有变异类型。
