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动植物de novo测序
? ? ? ?动植物de novo测序即动植物从头测序，指不需要任何参考序列信息即可对某个物种进行测序，用生物▂信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列Ψ图谱。利用全基因组从【头测序技术，可以获得动植物的全基因组序列，带动这个物种下游一系列研究的开展，从而推进该物种的研究。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组▲数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台，为后续的基因挖々掘、功能验证提供DNA序列信息。
产品优势
测序通量高：30+DNBSEQ、1台PacBio?Sequel?、1台PacBio?Sequel?II、2台?Nanopore?PromethION测序仪保证超高测序通量。
测序质∑量好：每种㊣ 测序平台均执行严格质控，保证测序质ξ 量。?
平台多「样化：PacBio/Nanopore/DNBSEQ/Hi-C/stLFR多技▆术平台，为基因组组装提供整体解决方案。
应用范围广：基因组图谱的完成为后续基因挖掘、物种起源及进化○等研究提供大量数据支撑。?
项目经♀验足：分析人员从业时间久、资历深、经验丰富，精通基因组产品相关的各△种分析，为项目的顺利◆交付保驾护航。
?结果产出高：华大基因已经成功完成1,000多个物种的全基因组从头测序，合作发表动↑植物de novo文章310篇，封面文章29篇。
产品应用
- 获得物种的参①考序列
- 研究︼物种起源与进化历史
- 挖ζ掘功能基因
- 搭建物种数据库
研究内容
基因组Survey：
通过多个Kmer估计基因组大小和基因组杂合率，重复水平（软件Jellyfish+genomeScope）
基因组组装(PacBio HiFi)：
1. 组装
2.?BUSCO评价
基因组组装(PacBio CLR/Nanopore+NGS)：
1. repeat注释
2. 基◤因结构注释（建∮议提供同源物种 5-6 个以及转录组数据）
3. 基因功◆能注释
4. 转录因子预测（植物）
进化分析：
提供已发表物种和近缘物种（选择 10 个物种以内）
1. 因家族鉴定（OrthoMCL/OrthoFinder）
2. 物种系统☆发育树构建（phyml, Bayers, RAxML, iqTree）
3. 物∴种分歧时间估算（PAML）
4. 基因组共线性◢分析※（植物，物种自身 MCScanX；物种间JCVI）
5. 全基因组复制分析（植物，Ks，4DTv）
6. 基因家族扩张收缩分析（CAFé）（结果有无取决于分歧时间差异大小，分歧时间差异较大无结果）
Hi-C辅助组装：
1. 文库评估
2. Hi-C分析
3. 手工矫正，获得染色体
4. 近缘物种比较，染色体╱定名
定制化信息分析：
可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析内容
案例一：多平台构建鸭嘴兽和短鼻针鼹的高质量基因组
? ? ? ?生活在澳洲大陆的鸭嘴兽和针鼹，组成了哺乳动物原兽亚纲的单孔⌒目。相比其他哺乳动物，单孔目有很多独特之处，如单孔卐目动物排尿、排便、生殖都共用一个孔，这也是单孔目得名的由来。不仅如此，单孔目动物的染色体结构也异乎寻常：包括人类在内的其他哺乳动物一般只有一→对性染色体，雌性XX和雄性XY，而单孔目动物却有㊣ ∏5对10条性染色体。单孔目动物凭借其非凡▼的生物学特性和独特的演化地位，在哺乳动物起源与演化研究中备受科学家青睐。
1. 构建染色体级别的高质量基因组
? ? ? ?基于PacBio、Bionano、Hi-C等最新测★序方法，华大与合作〖伙伴为鸭嘴兽和针鼹这两个物种构建了染色体级别的高↘质量基因组，为后续研究内容的开展△提供了坚实的数据支撑。
图 鸭嘴兽性染色体组装及其特性
2. 构建出现生哺乳动物的祖先染色体
? ? ? ?对于现生哺乳动物的共同祖先，能通过化石证据还原它们的一部分外观特征，但其染色体数目〖尚不清楚。基于本项研究产生的两个高质量单孔目基因组ξ ，研究团队首次构建出现生哺乳动物最近共同祖先染色体（2n=60），绘制了现生哺乳动物早期祖先的演化图谱。现生哺乳动物的共同祖先生活在距今约1.8亿年前，染色体数为60条；兽亚纲哺乳动物共同祖先出现○在距今约1.6亿年前，染色体数为36条；有袋类哺乳【动物祖先出现在距今约8千万年前，染色体数为14条。
图 哺乳动物核型进化轨迹
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3. 单孔目的性染色体形成机制
? ? ? ?研究团队发现，单孔目物种的5条X染色体与↑其他绝大多数哺乳动物的X染色体序列并不相似，但有一部分序列跟鸟类的性染色体同源。进一步与其它物种基因组进行比较分析，研究人员发现，此前针对单孔目性染色体形成机制的主流假设——5对性染色体由两个古老的单【孔目类群杂交产生——并不成立，提出单∞孔目中的多对性染色体更可能是通过多对古老的常染色体√相互之间发生了非同源片段的交换，即转座异位事件，在多次交换之后，形成了如今的5对性染色体。并推测在单孔目性染色体演☆化的初期，5对性染色体可能在减数分裂时形成一个首尾相接的罕见环状结构，但这个结构随着Y染色体的一步步退化最终断开，形成了我们现在观测到的链状结构。
4. 单孔目动物独特的生物学特性相关基因
? ? ? ?研究团队▆分析发现，单孔ㄨ目动物与人、考拉等哺乳动物※不同，保留了一部分与鸟类和爬行类相似的基因，这些基因参与卵的形成；相比于鸟类和爬行类，单孔目物种已经拥有一些参与乳汁分泌过程的基因，如合成乳汁中的』主要成分酪蛋白的基因；成年的鸭嘴兽⌒和针鼹没有牙齿，胃也基本退化，研究发现在鸭嘴兽和针鼹基♂因组当中，许多与牙齿和胃发育相关的基因已丢失，比如与牙齿形成、生长以及牙釉基质矿质化过程相关的odontogenic ameloblast-associated基因，以及引导ATP酶将氢离子泵入胃中、刺ω 激胃酸分泌的gastrin胃泌素基因，均已丢失；针鼹的㊣ 嗅觉受体基因明显多于鸭嘴兽和】其他哺乳动物；而在鸭嘴兽基因组当中，与夜行性相关的犁鼻器受体基因数量则明显更多。
? ? ? ?本研究不仅突破了性染色体组装的技术难题，构建得到了优¤质的单孔目参考基因组，还通过精妙的数据分析，追溯了距今1.8亿年前现生哺乳↘动物共同祖先的染色体图谱，帮助学界更好地理解物种演化过程的分子机制，此外也找到了特定的基因，解释了单孔目动物独特生ξ物学特性的产生机制。
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参考文献
Zhou Y, Shearwin-Whyatt L, Li J, et al. Platypus and echidna genomes reveal mammalian biology and evolution[J]. Nature, 2021: 1-7.
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1. 基因家族鉴定
? ? ? ?通过〓同源基因的鉴定及基因家族的聚类分析，得到保守的单拷贝基因家族和多拷贝基因家族，以及物种特有的基因和家族，它们可能和物种的特异性有关，可以为物种特性的研究提供基础。通过Orthofinder软件对蛋白基因集进行聚类得到基因家族信☉息。
图1：A图表示不同物种间直系同源基因的种类及数◣量； B图表示不同物种间直系同源基因的种类及数量韦恩图；
2. 系统发育分析
? ? ? ?利用单拷贝Ψ基因家族构建物种发育树。根█据基因家族聚类的结果，使用单拷贝直系同源基因利用MUSCLE?、Gblocks?0.91b、RaxML软件进行多序列比对，提取保■守区域，构建进化树，并使用FigTree进行定根。
图2：系统发育树
3. 物种分化时间估算
? ? ? ?通过每个单拷贝基因家族中的简并位点、系统发育中的←定根树及已知物种的分化时间，使用PAML软▓件估算分子钟和物种间的分化时间。
图3?物种分化时间。每个分枝长度代表中性〇进化速率，树形结构节点处数字表示支持率
4. 基因家族扩张与收缩分析
? ? ? ?通过基因家族的信息、计算得到的系统发育树和物种分「化时间来进行基因家族的←扩张与收缩分析。
图4 扩张与收缩的基因家族GO功能富集
5. 基因组№共线性分析
? ? ? ?共线性片段指同一个物种内部或者两个物种之间，由于复制（基因组复制、染色体复制或者大片段复制）或者物种分化而产生的大片段的同源性现象。在共线性片段中的基因在物种进◆化过程中保持了高度▅的保守性。现在常采用 MCScan、MCScanX或JCVI软件▲进行分析。
图5 自身共线性分析↙
图6 物种间共线性分析
6、全基因组复制分析（ks）
? ? ? ?Ks分析物种在进化史中是否发生全基因组复制事件、以及通过它与其它植物分化时间的比较区分发生全基因组复制相对』时间的早晚。将筛选到的共线性基因及其比对结果利用PAML软件对每个基因对进行Ks计算，推断物种分化时间节点或者全基因组复制时间。
各个平台DNA送样要求
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平台 |
文库类型 |
样本量（基因组DNA） |
浓度 |
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Nanopore PromethION |
20-40Kb? library |
≥9μg |
90 ng/μl |
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Ultra-long library(>40k) |
≥10μg |
150??ng/μl |
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PacBio Sequel II |
15-20Kb HIFI library |
≥15μg |
80 ng/μl |
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20-40kb CLR library |
?≥7μg |
70? |
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DNBSEQ |
350bp library |
≥1μg |
12.5 ng/μl |
|
StLFR library |
≥500ng |
1 ng/μl |
注：大片段文库不建议客户送DNA样本，建议直接√送组织，详细组织ω 送样建议请联系当地销售。
Q1：怎么查询基因组的大小？
答：查询植物基因组大小的网▓站：http://data.kew.org/cvalues/CvalServlet?querytype=2；
查询动物基因组大小的网站：http://www.genomesize.com/search.php。
换算关系：1pg=978Mb。
Q2：基因组从头测序的组装结果好坏如何判断？
答：一般用contig N50和scaffold N50 来衡量基因组组装结果的好坏。N50是指把组装出』的contigs或scaffolds从大到小排◥列，当其累计长度刚刚超过全部组装序列总长度50%时，最后一个contig或scaffold的大○小即为N50的大小，N50对评价组装序列的连续性、完整性有重要意义；N70和N90的计算方法与N50类似，只是百分数变为70%或90%。
Q3：PacBio测序的优势是什么？
答：优势ㄨ是测序读长长，平均读∮长在15K以上，且无GC偏向性；对基因组的组装、大的结〓构变异检测、转录组全长测序结果均有极大提升。
Q4：进行基因组组装有哪些测序策略推荐？
答：以下是我们推荐的基因组组装策略，我们的技术团队会」根据物种特性推荐合理的方案。
