案例1??ChinaMAP 分析 10,588 个人的高深度全基因组序列[1]

研究材料：10588个中国人，随机选择于中国27个省份的8个民族(汉族、回族、满族、苗族、蒙古族、彝族、藏族和壮族)?。平均基线年龄为54岁，女性为64.8%。

分析内容：构建高质量的中△国人群遗传变异数据、中国人群体结构分析、基因组特征比较以及变异频谱和致病性变异解析。该研究也通过全基因组关联分︼析探索了中国№人群中2型糖尿Ψ病和肥胖遗传相关因素。在血糖相关分析中，结果验证了部分已知的2型糖尿▃病风险高频基因位点，包括CDKAL1、SLC30A8、SND1-PAX4、IDE-KIF11-HHEX、CDKN2A-CDKN2B、KCNQ1?等，也鉴定和发现了DENND5B、ORM1?、MAFA、PAX6、SOX4?等新位点。

重要研ω　究成果：

图1 ChinaMAP基因变异的分布和模式

图2 体重指数与血糖的关联分析

ChinaMAP研究也通过全基因组关联分析探索了中国人群中2型糖尿病和肥胖遗传相关因素。在体重指数BMI相关分析中，研究⌒团队发现了新的东亚人群特异性CADM2基因位点，CADM2在动物研究中已证实参与调节体重和能量稳态。而FTO等基因在欧美■人群中发现的重要肥胖相关基因位点，在ChinaMAP研究结果中并不显著。从这【些发现可以提示我们，对大规模中国人群特异性的基因组学的研究，对分子机制和个▽体化诊治的精准医学体系建立很重要。

案例2?NBT：主流高通量测序仪在人/细菌/宏基因组测序评测结果发布[2]

由生物分子资源设施协会（Association of Biomolecular Resource Facilities, ARBF）主导的ABRF NGS II期研究成果发表于Nature Biotechnology，文章题为“Performance assessment of DNA sequencing platforms in the ABRF Next-Generation Sequencing Study”。研究团队基于来自Illumina、Pacific Biosciences、Thermo Fisher Scientific、BGI、Oxford Nanopore Technologies和Genapsys的多款测序平台，在多个实验室对同一人类基因组家族、三个︾单独菌株和十种细菌的宏基因组混︻合物进行测序，并将各平台数据进行全方位、系↑统性比较，分析各〗个测序平台的性能差异和测序质量，以提供真实◣全面的参考证据。

数据显示，在短读长测序平台中，DNBSEQ平台提供了非常低的测序错误率。且SNP/Indel检测的灵敏度和准确度表现也非常优秀。

案例3?DNBSEQ基因组测序揭示肺鳞癌的潜在治疗靶标^[3]

Genomic sequencing and editing revealed the GRM8 signaling pathway as potential therapeutic targets of squamous cell lung cancer

肺腺癌和肺鳞癌（LUSC）是肺癌的主要病理类型，肺鳞癌占原发性肺癌的40%～51%。目前已经有多种靶向药物应用于肺腺癌，但是肺鳞癌的治疗靶点尚卐没有突破性进展。文章通过外显子重测序（WES），人全基因组重测序（WGS）、靶区域捕获测序（TS）和CRISPR-Cas9基因组ζ编辑技术，利用鳞状细胞ζ肺癌手术肿瘤和对应的源自患者的异种移植瘤（PDX）样本探索和验证肺鳞癌的潜在治疗靶标。

文章亮点：

• Illumina HiSeq X Ten平台WES测序+ DNBSEQ平台WGS测序+ DNBSEQ平台TS测序，多平台数据联合分析
• LUSC PDX模型可广泛应用于潜在治疗目标和策略的验◤证
• 使用CRISPR系统对PDX肿瘤细胞中的驱动基因进行功能验证

通过基因组测●序和CRISPR-Cas9基因组编辑的综合分析，在手术和PDX肿→瘤上整合鉴定并验证了GRM8对LUSC肿瘤的促进■功能。cAMP活化剂和MEK抑制剂可显著阻断具有GRM8突变的LUSC肿瘤细胞的增ㄨ殖和存活。因此，GRM8信号传导通路ζ　的组成分子可能成为携带GRM8激活突变的鳞状细胞肺癌的治疗靶标。

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案例4?BGISEQ-500和HiSeq X Ten全基因组测序鉴定生殖细胞和体细胞变异^[4]

Germline and somatic variant identification using BGISEQ-500 and HiSeq X Ten whole genome sequencing

该研究使用BGISEQ-500平台对三种恶性胸膜间皮瘤及其对照的正常样本进行全基←因组测序Ψ，并与Illumina HiSeq X Ten平台测序结果进行评估※。两平台数据均使用相同的分析流程，分别比较生殖细胞和体细胞单核苷酸变异（SNP）、小插入或缺失（InDel）。结果表明BGISEQ-500平台通过全基因组测序来鉴定肿瘤▅样本的体细胞和生ㄨ殖细胞突变是①有潜力的可适用性的平台，这也是该平台首次公开可用的癌症基因组数据。

研究结果：

• 生殖细胞↙突变：? ? ?
  

结果显示，BGISEQ-500平台和HiSeq X Ten平台识别SNP的能力与SNP分型芯片（Infinium Omni2.5–8, Illumina ）是高度♂一致的（> 99％）。在两个测序平台中鉴定的生殖细胞SNV和indels也是高度一致（分别为86％和81.5％）。

表??SNP芯片数据分【别与BGISEQ-500和HiSeq X Ten数据比较，生殖细胞突变基因型一╱致性的百分比

• 体细胞突变：
  

? ??????三名患者中总共10,890个体细胞SNV，大部分体细胞SNV（72％）在两个平台中被识别，小部分为BGISEQ-500和HiSeq X Ten两平台特有的（分别为14%，14%）。

图? 利用BGISEQ-500和HiSeq X Ten的数据鉴定3个胸膜间皮瘤的体细胞突变

案例5?基于DNB的测序平台可有效避免index hopping[5]

Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform

本研究使用三种主要的文库「制备方法研究了DNB测序平台的Index hopping问题。DNBSEQ测序仪利用独特的DNA纳米球（DNB）技术，基于滚环复制（RCR）进行文库扩增，这种线性扩增可以→避免常规PCR带来的错○误累积。基于DNB的NGS应用仅使用单↑个index就实现了前所未有的0.0001％至0.0004％低样本错误分配率。此外，用水代替DNA，加入index，增加空白对照，DNB测序平台发生错误匹配的概率为36 million reads分之一，即0.0000028％。

图? 不同测序技术的index hopping比例

研究结果：

• DNA纳米球技术的高index保真度
  

? ? ? ? DNBSEQ平台将DNB加载到规则阵列（patterned arrays）上，并利用组合引物锚定测序技术（cPAS）进行测序。 独特的DNB技术采用具有强链置换活性的Phi29聚合酶和能够进行线性扩增的RCR工艺，每个扩增循环都以原始的单链环状DNA文库为㊣模板，保持每个拷贝子的独立性（图1a）。因此，即使出〗现寡核苷酸的index hopping等错误，也不会累积错『误拷贝，正确的序列总是会在后面的DNA拷贝〖中复制，保证高的扩增保真度。

图??Index hopping在不同的测序平台产生的机制

• PCR-free文库index hopping污染率极低

? ??????除了常规PCR文库外，文中还对PCR-free文库在DNBSEQ平台的index hopping情况进行调查，未经过任何Q30过滤的99.9998％精度↙再次证实了DNB可以在很大程度上降低index污染。与上面的◥常规PCR文库类似，污染率平均约为0.0004%。

表? PCR-free 文库index污染比率

研究意义：

1、? 高的检测◢准确度，保证体细胞低频突∞变、HPV检测等基因检测的准确性；

2、? Single index避免了繁琐的non-combinatorial dual index带来的额外成本和劳动力浪费；

3、? 避免大通量测序中样本数据完整性的丢失。

参考文献

[1]? ? Cao Y, Li L, Xu M, et al. The ChinaMAP analytics of deep whole genome sequences in 10,588 individuals[J]. Cell research, 2020, 30(9): 717-731.

[2]? ? Foox, J., Tighe, S.W., Nicolet, C.M. et al. Performance assessment of DNA sequencing platforms in the ABRF Next-Generation Sequencing Study. Nat Biotechnol 39, 1129–1140 （2021）.

[1]? ??Genomic sequencing and editing revealed the GRM8 signaling pathway as potential therapeutic targets of squamous cell lung cancer.[J]. Cancer letters, 2018.

[2]? ???Patch A M, Nones K, Kazakoff S H, et al. Germline and somatic variant identification using BGISEQ-500 and HiSeq X Ten whole genome sequencing.[J]. Plos One, 2018, 13(1):e0190264.

[3]?? ? Li Q, Zhao X, Zhang W, et al. Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform. bioRxiv, 2018: 343137

1、标准品数据展示

? ??????测试样本选用了“瓶中基因组□　（Genome in a Bottle）”的人类样本NA12878，这是目前╳被世界上认为研究相对透彻的二倍体人类基因组，并发布了高置信变异集，可作为一□个重要工具来了解测序仪和检测结果的表现。X测序平台的数据为I 公司官网下◆载的数据，并且，两个平台的分析均严格采用了GATK Best Practices推荐的流程进行分析。

• 高测序数据质量
  

? ? ? ? 测试数据有至少97%的碱基识别准◣确率高达99%，至少89%的碱基识别准确率高达99.9%。

Q20＞97%，Q30＞89%

图? ?Raw data测序质量

? ??????测序质量值可衡量碱基未正确ㄨ检出的概率。测序技术，一种类phred算法[1,2]会为片段中的每个碱基分配一个质量分值，与最初因桑格测序实验而开【发的算法类似。

? ??????一个给定碱基的※测序质量分值Q定义为下面的等式： Q = -10log10(e) 其中，e为预计碱基检出∴不正确的概率。如下所示，质量分值20表示错误率为1/100，相应的检出精确度为99%。

表? 标测序质量分值与↓碱基检出精确度的关系

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• 高比对率和覆盖度
  

? ? ? ? 分别在DNBSEQ和N两个平台上测了90Gb、97Gb数据和105Gb、111Gb数据。从下表可以看出，由于N平台Duplicate rate较高，需多测10%的数据，才有和DNBSEQ平台相当的有效深度。

表 DNBSEQ与N平台比对数据比较

Clean bases：过滤掉♂接头，低质量和◣含N的reads后剩下的碱基数量；

Mapping rate：碱基比对率，比对到卐参考基因组的碱基数目除以clean data的碱基数目，如果测序样本存在污染或者与参考基因组差异较大，比对率偏低会影响后续的信息分析；

Unique rate：比对到∞基因组上唯一位置的base比率，一条reads在相同数量的容错时会有两个或者两个以上的位点都吻合，那么，它的比对结果不〓唯一。对于某些下游分析，需要∑　去除比对多个位点的reads，只保留唯▂一比对的reads；

Duplicate reads：重复的 reads 所占比例，为了保证后续变异分析的准确性，会去掉duplicate reads后进行下游信息分析，相同数据量重复率越低，后续卐可用的数据量越多；

Mismatch rate：碱基的错配率；

Average sequencing depth：有效平均深度（不计算duplication），比对到々参考基因组的碱基数目除以基╲因组的大小；目前行业对外承诺的30X（90G）、40X（120G）等深度只是测序量的简单换算，并不是指有效深度。

Coverage at least 1X（4X、10X、20X）：覆盖率，指测序深度达到1X、4X、10X、20X以上①的全基因组占比。

• 高灵敏度和精◇准度
  

? ??????高高灵敏度（Sensitivity）和高精准度（Precision）意味着DNBSEQ平台检测发现变异的能力更强，并且结果中为真的突变的概率也高。

图DNBSEQ与N平台SNP精准度和敏感度对比

图 DNBSEQ与N平台InDel精准度和敏感度对比

Sensitivity：灵敏度，又⌒　叫真阳性率（TPR），计算公式：灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）。是指←实际为阳性的样本中，判断为阳性的№比例。例如，真正突变中，被判断为有突变的比例，它反映筛检发现变异的能力，灵敏度越高，假阴性越低；

Precision：精准度，也叫阳性⌒预测值（PPV），计算公式：精准度=真阳性/（真阳性+假阳性），指筛检试验检出的全部阳性变异中，真正“变异”的例数（真阳性）所占的比例，反映筛检变异结果阳性中为真的突变的可能性，精准度越高，假阳性越低。

• 高变异结果一致性
  

? ? ? ? DNBSEQ平台内SNP一致性99%，与N平台间一致性高达98.67%。对于InDel检测一致性，DNBSEQ平台内重【复一致性87.94%，远高于N平台内重复一致性79.43%。两平台】间的InDel一致性81.98%。

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图 平台内与平台间的SNP／InDel一致性对＠比?

2、已交付商业∑　样本数据展示

? ??????目前华大基因已成功交付上万例高质量的BGISEQ平台 WGS数据，并得到了海内外业界高〗度认可。其中包括贝勒医学院（Baylor College of Medicine）、华盛顿大学（University of Washington）、斯坦福大学（Stanford University）、麻省理工(Massachusetts Institute of Technology)等早期参与人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)的主要单位，以及牛津大学(University of Oxford)、梅奥诊所(Mayo Clinic.)、康奈尔大学(Cornell University)、费城儿↓童医院(CHOP)、德国癌症研究中心(German Cancer Research Center)、中南大学↓湘雅医院、同济医院、清华大学等上百家全球☆知名科研单位卐参与平台测试。通过对不同样本类型测试和不同测序平台比较，均获得较高的数据质量结果。在这里我们随机统计了去除样本背景信息后的1,355个样品下机数据∞，统计具体的质量表现。

• 样本类型适用广泛
  

? ? ? ? DNBSEQ平台 WGS数据来源样本种类多样，其中包含福尔马林固定石蜡包埋( Formalin Fixed and Paraffin Embedde, FFPE)样品、单细胞样品、血液样品、基因组DNA样品、唾液样品、常规冷冻保存的新鲜组织样品等，不同样本类型均有较高的交付成功率，基于BGISEQ平台交付※的样本中，常规基因组建库测序成功率高达99%，对于降解样品如FFPE等，建●库测序成功率也高达90%以上。

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图? DNBSEQ平台 WGS不同类型样品交付成功率

• 数据利用率高
  

? ??随机统计了1,100条lane的DNBSEQ平台 WGS 下机数据，利用率平均♀高达99%。

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图? ?Clean data比率

• 测序数据质量优
  

? ??????对随机挑选的1,355条lane DNBSEQ平台 WGS数↘据质量值进行统计分析，下机Raw data Q20平均值为96.16%，Raw data Q30平均值为87.86%。

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图? 碱基质量△分布

• GC含量稳定
  

? ??????对该1,355条lane数据的GC含量进行统计分析，平均GC含量为41.69%, GC含量稳定，没有偏向性▲。

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图? GC含量分布

*上述分析结果由华大信息分析流程所得，本结果不代表交付指标，最终解释权归深圳华大基因股份有限公司所有

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? ??????华大基因作为全球领先的基因组学研究中心及临床解读中心，推出的自主研发》的DNBSEQ平台 30X WGS测序在成本和技术上极大的促进了基因组学的快∴速发展，使基因组学真正的进入了百元基因组时代。DNBSEQ平台见证了人类基因组计划以来◥一个新时代的开启Ψ ，将推动以基因测序作为支撑的生命科学、生物产业甚至生命经济蓬勃发展，以其低廉的成本、高质量、高通量的测序平台，真正实现人类基因组计划以来科学家们的梦想和希望！

参考文献：

[1]? ??Ewing B, Hillier L D, Wendl M C, et al. Ewing B, Hillier L, Wendl MC et al.Base-calling of automated sequencer traces using PHRED. I. Accuracy assessment. Genome Res 8:175-185[J]. Genome Research, 1998, 8(3):175-185.

[2]? ??Ewing B, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities[J]. Genome Research, 1998, 8(3):186-94.

[3]? ??Carrick D M, Mehaffey M G, Sachs M C, et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue[J]. Plos One, 2015, 10(7):e0127353.

表1? DNA样本送样建议

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表2? ?组织样本送▃样建议

Q1：DNBSEQ人全基因组重测序的数◥据格式是否与Illumina平台的一致？

答：是一致的，所以信息分析流程都一样。?

Q2：想对我们DNBSEQ产出的数据先分析确定一下格式和数据质量，现在是否有测试过的数据可以提¤供？

答：DNBSEQ demo数据已经开放，可以访问并下载，链接如下：

https://db.cngb.org/cnsa

表1 上传数据对应ID

Q3：如何实现基因组变异可视化？

答：基因组可视化软件 IGV(Integrative Genomics Viewer)是高性能的基因组数据可视化工具，能够帮助使用者同时合并分析不同类型的基因〓组数据，并能灵活放大基因组上的某个特定区域。IGV 软件免↘费下载地址: http://www.broadinstitute.org/igv. IGV 可查看 SAM / BAM 比对文件和 VCF 变异检测文◎件，下图显示的是 IGV 可视化窗口。

图1? ?IGV可视化窗口示意☆图

Q4：如何寻找候选变异？

答：寻找候∮选变异位点时，可利用变异注释结果，关注非同义突变、剪接突变、移码突变。1)去除千人基因组数据库中 MAF >=1% 的变异2)去除 NHLBI-ESP6500 European American 群体数据库中 MAF >=1% 的 变异 3)去除 NHLBI-ESP6500 African American 群数据库中 MAF >=1%的变异4) 推 测 变 异 的 致 病 性 。 利 用 SIFT/PolyPhen2/Mutation assessor/Condel/FATHMM 进行打分，预测某个变异和氨基酸置换是否影响蛋白 功 能 。 如 果 score<=0.05 或 PolyPhen2>=0.909 或 MA score>=1.9 或 Condel = deleterious 或 FATHMM=deleterious，就推测该变异可能是有害变异。

Q5：SNP 筛选所使用的数据＠库有哪些，怎么筛选?

答：数据库: dbSNP 、 HapMap3、 1000 Genomes 一般情况︽下，我们都采用以下过滤标准: 1、质量值不低『于 20; 2、覆盖深度不低于 4; 3、两个相邻 snp 之间的距离〗不小于 5，如果样本深度很高(>50X),可以提高过滤条件。

Q6：一般用什么方法来验证 call SNP 准确率?

答：华大炎黄计划是用 Sanger 测序的方法和芯片分型两种方法◢来验证 SNP 的准确性的， 因为 Sanger 测序被认为是测序中的“金标准”。?

Q7：唾液采集的方法？

答：使用DNA Genotek公司的?Oragene?DISCOVER (OGR-500) (For Research)?或?Oragene?Dx (OGD-500) (For Diagnostics) collection kit.保存量及操作方法详＠ 见产品说明书，按照说明书操作ω　保存运输样品。

Q8：突变位点为有效位ξ　点时使用的 depth 阈值是多少?

答：GATK在call变异时SNP和InDel均要求depth大于等于4 。

Q9：数据中的 Duplicates 指什么?如何定义?有何影响？

答：一般情＠况下，测序得到了两对或两对以上的pair end reads同时比对到参考序列↑上相同的起始和结束位置，我们定义这种序列为duplicates。

在数据分析过程中，为了确保变异分析的准确性，避免计◆算存储资源的浪费，一般会通过生信的方法去掉Duplicate reads后再进行下游信息分析。

但这么做，至少会带「来以下2方面的问题：

1、 数据◎量浪费

越高的duplicates比例，为此而∩浪费的数据量就越大。按照illumina平台为例，普遍的duplicates比例大约在10%左右。也就是花了100G data的钱，有用的只有90G左右。

2、 对于RNA-Seq，无法去除

对于RNA来说，因为难以♂区分是PCR duplicates还是RNA高表达形成的相同的模板，则无法去除duplicates。从而影响转录组表达量的准确性，尤其是小和中等表达量的转录本的准确性。