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环状RNA测序
? ? ? ? ?环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，与传统的线性RNA（linear RNA）不同，circRNA分子合呈封闭环状结构，且不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。华大推出环状RNA高通量测序服务，可进行环状RNA的鉴定以及环状RNA与miRNA‘’海绵效应‘’分析， 可实现ceRNA（competing endogenous RNAs，内源竞争RNA）机制等╱研究。可应用在物种环状RNA表达谱构建，环状RNA疾病生物标记开发，环状RNA作用机制研究等方面。
技术优势
信息分析内容
一、标准信息分析
? ? ? 1. 基本数据统计
? ? ? ? 1.1去除接头序列、低质量序列得到clean data
? ? ? ? 1.2与核糖体数据库比对，去除核糖体RNA数据
? ? ? 2. 环状RNA预测鉴定
? ? ? 3. 环状RNA所在线性基因注释
? ? ? 4. 环状RNA在基因组『上的定位
? ? ? 5. 环状RNA表达定量分析
? ? ? 6. 样品(组)间表达差异分析
二、高∏级信息分析
? ? ? 1. 差异环状RNA来源的基因GO功能及富集分△析
? ? ? 2. 差异环状RNA来源的基因Pathway功能及富集分析
? ? ? 3. 环状RNA与miRNA互作分析(适用于人/小鼠物种)
华大circRNA研究——环状RNA circβ-catenin的翻译通过激活Wnt通路促进肝癌细胞生长
Translation of the circular RNA circβ-catenin promotes liver cancer cell growth through activation of the Wnt pathway. Genome Biol 20, 84 (2019).
研究概要：
目前肝▓癌是一个全球性健康问题，在过去的几十年里有许多信号通路被证实参与了肝癌的发生，Wnt/catenin通路↘作为一种高度保守的通路，广泛参与多种病理事件。在本研究中，本次研究利用在线数据库中的RNA测序数据进行●分析，确定了一个来自于catenin基因的circRNA，命名为“circβ-catenin”。功能研究表明，敲除circβ-catenin可抑制体内和体外癌细〓胞的生长。随后的研究表明，circβ-catenin编码一种新的370个氨基酸的β-catenin同工型。该同工々型保护β-catenin免受GSK3β介导的降解，从而增强Wnt /β-catenin途径的激∮活。
研究结果：
1. 人细胞系〒中WNT通路相☆关环状RNA的生物学分析以及circβ-catenin在人细胞系和◣组织中的表达
研究人员计算了7个非癌细胞◥系和6个癌细胞系中Wnt通路相关环状RNA的数量，发现大多数可以产生数百个Wnt通路相关环状rna。接下来重点关注HepG2细胞系的肝脏来源。发现48个Wnt通路相关基因在HepG2细胞中产生131个环状RNA。通过使用cDNA样本中的发散引物和Sanger测序，证实了头尾剪接(back-splicing)发生在catenin的※外显子中。然后设计了收敛型和发散型引々物，分别检测线β-catenin mRNA 和环状circβ-catenin。结果提示circβ-catenin比其线性同源β-catenin mRNA更稳定。还进行了Northern blotting检测circβ-catenin和线性β-catenin mRNA的RNA水平。还检查了circβ-catenin蛋白和β-catenin mRNA在不同人体组织中的表达谱，发现circβ-catenin表达与组织中的线性的β-catenin mRNA呈正相关。
图1. circβ-catenin 在人细胞系和组织中的表达
2. circβ-catenin的敲低抑制肿瘤的生长和转移↘∩
为了评估circβ-catenin的生物学重要性，分析了circβ-catenin在肝癌组织中的表达，发现circβ-catenin在肝癌组织中显著升卐高，针对circβ-catenin的shRNA病毒载体沉默了两种肝癌细胞系中circβ-catenin的RNA水平。然而circβ-catenin的敲除并不影响β-catenin mRNA的表达水平。MTT检测，集落形成检测和流式细⌒ 胞术检测表明，circβ-catenin的沉默新住抑制了肝癌细胞的生长和细胞周期进展，愈合实验◆显示，circβ-catenin的沉默抑制了癌细胞的迁移。侵袭实验表明，circβ-catenin的沉默也会损害细胞的侵袭能力，挽救实验表明circβ-catenin的异位表达可以挽救shRNA介导的▽表型。
图2. circβ-catenin的敲低体外肝癌细胞★的增殖和转移
3. circβ-catenin的沉默抑制了Wnt/β-catenin的通路
为了阐明circβ-catenin在肝癌中①的潜在的分子机制，分析⌒了敲除circβ-catenin后的全部RNA的表达谱。RNA-seq的数据的生物信息学分析显示，受circβ-catenin影响的基因在Wnt/catenin通路中显著富集。也通过RT-PCR进行ξ了数据验证。研究人员合成了针对circβ-catenin或β-catenin mRNA的不同siRNA的siRNA, 尽管siRNA不会影响β-catenin的mRNA水平，但是显著∑降低了β-catenin的蛋√白水平。随后的研究表明，靶向circβ-catenin的siRNA可以显着降低带有β-catenin结合㊣ 位点的TOPflash载体的荧光素酶活性，而不会改变具有突变的β-catenin结合△位点的FOPflash载体的荧光素酶活性。
图3. circβ-catenin的敲低抑○制了Wnt/β-catenin的通路
CircRNA biomarker鉴定——来自ANXA2基因转录的环状RNA可作为神经性多发性硬化症诊断★的biomarker
Circular RNA profiling reveals that circular RNAs from ANXA2 can be used as new biomarkers for multiple sclerosis[J]. Human Molecular Genetics, 2017
发表单位：西班牙Biodonostia健康研究中心等
研究摘要
为寻找多发性硬化症（MS）患病诊断『的biomarker，本次采用患病组和对照组各选4个血液白细胞样︽本进行研究，在406个差●异表达环状RNA中找到2个目标环状RNA：circ_0005402和circ_0035560，在20个患病RR-MS个体中和18个正常人中进行验证，使用The Wilcoxon test证实这两个环状RNA在患病中显著低表达。并通过ROC 生存曲线分析：circ_0005402、circ_0035560 敏感性和特异性较高，可作为潜在的临床患病诊々断的biomarker。
部分研究结果展示
1、共发现406个差¤异表达环状RNA，其中324低表达，82高表达；通过qPCR验证10个差异表达环状RNA, 其中5个高表达，5个低表达，其中验证率为90%。
图1 多发性硬化症环状RNA差异分析，a：差异环状RNA火山图分析；b：差异环状RNA聚类图◥分析；c：qPCR验证结果
2、通过ROC生存分析，结果显示来自ANXA1-mRNA, circ_0003452_2 和circ_0005402具有较高敏感度，可作Ψ为潜在诊断的biomarker。
图2 ANXA1-mRNA, circ_0003452_2 and circ_0005402 ROC生存曲线分析
外圈表示染色体，内圈表示以1,000,000个碱基为滑动窗口时，circRNA数目在染色体上的╲变化。
X轴为样品名称，Y轴为log10(RPB)，每个区域的箱线图对应五个统计量（自上而下分别为最大值、上四分位数、中值、下四分位数和最小值）。
X轴代表log2转换≡后的差异倍数值，Y轴代表-log10转换后的显著性╲值。红色代表上调的circRNA，蓝色代表№下调的circRNA，灰色代表非差∩异的circRNA。
X、Y轴均代表circRNA表达量的对数值。红色代表上调的circRNA，蓝色代表下调的circRNA，灰色↘代表非差异的circRNA。
X轴代√表聚类分析的样品，Y轴代表差→异circRNA。颜色代表log10转换后的表达量（颜色越深表示表达量越高，越浅表示表达量越低）。
X轴代表差异◢表达circRNA来源基因的数目，Y轴代表GO功能分类。
X轴代表基因所占的比例，Y轴代表KEGG功能分类。将基因根据参与的KEGG代谢通路分为7个分支：细胞过程(Cellular Processes)、环境信息处理(Environmental Information Processing)、遗传信息处理(Genetic Information Processing)、人类疾病（Human Diseasea）（仅限动物）、代谢(Metabolism)、有机系统(Organismal Systems)、药物开发（Drug Development）。
X轴代表富ξ集因子值，Y轴代表通路名称。颜色代表q-value(颜々色越白值越大，越蓝值越小)，值越小代表富集结果越显著。点的大小代表差异circRNA来源基因的数目(点越大代♂表数目越大，越小代表数目越少)。Rich Factor指的是富集因子值，是注释上某ζ 一通路的前景值（差异circRNA来源基因的个数）与注释上某一通路的背景值(所有circRNA来源基因的个数)之商，数据越大，说明富集结果越明显。
表1? CircRNA组织样品送样建议
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组织类型 |
具体要求 |
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新鲜培养细胞（细胞数） |
≥1×106
cell |
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新『鲜动物组织干重 |
≥50 mg |
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新鲜植物组织干重 |
≥200
mg |
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全血（哺乳动物） |
≥2.5 mL淋巴细胞 ≥2.5 mL Paxgene
Blood RNA tube / RNAprotect? Animal Blood Tubes收集的全血 |
表2? CircRNA测序样品判定标准
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样本类型 |
总量 |
浓度 |
RIN |
28S/18S |
基线和?5S |
纯度 |
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Total RNA |
≥5 μg |
≥40 ng/μL |
RIN≥6.0 |
28S/18S≥1.0 |
基线平整，5S?峰正常 |
无?DNA，蛋白/盐离子等污染，样本无色透明不粘稠 |
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Total RNA |
≥5 μg |
≥40 ng/μL |
RIN≥7.0 |
28S/18S≥1.0 |
Q1：Total RNA最低送样量是多少↘？
5 ug/单次，详细可见上面的↓送样建议。
Q2：环状RNA 推荐数据量？
根据饱和度分析，一般推荐10 G以上数据。
Q3：circRNA需▓要做生物学重复吗？
需要。至少3个，实际越多越好。
Q4：lncRNA数据分析和环状RNA标准建库◤流程（R酶富集方法）分析的结果有什么区别？
LncRNA数据（10 G clean data）鉴定到1千到2千个环状RNA，数量级在「千位；而富集方法可①鉴定到2万-3万个环状RNA，数据量级在万位；两种方式可根据客户研究目的和需求进行针对性推荐，如客户初期研究，可进行lncRNA建库测序方法，具有较高性价比；如果是针【对性的研究环状RNA，可推荐环状RNA标准建库▅方法。
Q5：环状RNA验证方法？
定量验证：根据junction位点设计引物进行qPCR验证；
功能验证：使用circRIP方法验证miRNA Sponge功能；使用miRNA敲除及拮抗等模拟物进行功能验证。
Q6：环状RNA（circRNA）是不是很稳定、不存在降解？
CircRNA即为成环的RNA分子，其特性即是〗不易被RNase R降解。但是，实际上，降解分两种，一种是RNase R的降解，一种是水解↓。水解是不区分环状或者非环状的过程，并且事实上环状更容易被水解，因为环状的碱基基团靠的近，羟基更容易去攻击磷酸羟基键。将circRNA放在室温或者60℃或者在镁离子作用∞下，它们依然较容易被水解。在使用RNase R降解的过程中，体系中含有镁离子（Mg2+），因此实际的操作过程可能存在对circRNA的水解。所以，RNase R降解法获得circRNA的这种操作，可以提高检测∩的敏感性，但是不能提高特异性。
Q7：如何预测circRNA？
因为在circRNA纯化收集的过程中，需要去除核糖』体RNA和线性RNA，然后打断成片段进行建库测序。在得到测序结果后，我们需要对circRNA进行预测鉴定。由于circRNA头尾相接易环化，如果测序结果能获得接头序列（Jumping Sequence），便认为是circRNA。
Q8：CircRNA适宜用芯片技术※还是测序技术？
建议使用测序技术，有利于新结果的发现和鉴定。
Q9：样本卐间鉴定circRNA的差异大吗？
大。样本均一化操作在circRNA中是错误的，因为circRNA不属①于上面所提到的“绝大部分基因”（这部分基因在均一化时我们认为几乎没有∏变化），因此它的含量存在较大变化。
