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细菌de novo测序
产品介绍
细菌基因组de novo是对细菌基因组测序后从头组装。步骤为先将细菌的染色DNA机械地随机切割成一定相对分子质量范围的片■段，根据不同的测序策略，构建对应大小』文库，然∮后进行大规模测序。最终的组装水▲平根据研究的需要和细菌本身的特点而定，其中最高的指标是一条contig，即基因组的完整序列。
在组装※的基础上，进行基因组组→分分析，功能注释等分析，推测ORF是否为真实蛋白编码序列，检↓查功能位点，分析共有序列或特征序列、单个基因或基因间相互作用、表达调控等◥功能，细菌de novo测■序已取代传统方法成为研究细菌进化遗传机制，关键功能基因的重要工具。可①以预测重要基因和蛋白以了解其功能和可能机制；在研究病原菌的致病性与疾病的预防和治疗方面，可以鉴定致病相关基因、开发和研究疫苗、开发新型抗生素等；在研究细菌进化方面，可以研究种内进△化关系。
产品优势
平台多样：多平台∩联合应用打造“极致完成图”
交付快速：有完善的分◇析流程ㄨ，一键式交付，周期短
附加值高：结题报告文章化，深入挖掘基因组信息
经验丰富：已完成上万个细菌de novo项目，发表细菌基因№组文章170多篇。
个性化分析：依据客户需求制定个性化信息分析方案
技术流程
测序策略
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小片段文库 |
PacBio
/ Nanopore文库 |
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细菌de novo |
初级组装 |
1
Gb |
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完成图 |
1
Gb |
1
Gb |
信息分析内容
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信息分析▽条款 |
信息分析内容 |
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基因组组分分析 |
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基因功能分析 |
2. 综合性抗生素耐药性（CARD）数据库
2. 碳水化合物相关酶（CAZy）数据库ζ注释々 |
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比较基因组分析（需要参考序列） |
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定制化分析 |
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案例一：鼠疫杆菌遗传多样性研究
Historical variations in mutation rate in an epidemic pathogen, Yersinia pestis
期刊：PNAS 发表时间：2013
案例描述：
鼠疫（plague）是鼠疫杆菌（Yersinia pestis, Y pestis）借鼠蚤传播为主的烈性传々染病，是广泛流行于野生啮齿动物间的一种自然疫源□性疾病，也叫做黑死病。临床上表现为发热、严重毒血◥症症状、淋巴结肿大、肺炎、出血倾←向等。鼠疫在世界历史上曾有多次大流行，在3个有记载的大流行期间导致了大约2亿人死亡，因此被冠上"最具毁灭性传染病"的名头。三次大流行第一◥次发生在公元6世纪，从地▲中海地区传入欧洲，死亡近1亿人；第二№次发生在14世纪，波及欧洲、亚洲和非洲；第三次是18世纪，传播32个国家。14世纪大流行时波及中国。鼠疫≡杆菌是鼠疫的病原体，过去的研究表明其由于起源较近，遗传多样性非常↓有限。
研究结果：
- SNP突变率分析
鉴定出的2,326个单核苷酸多态性（SNPs）中有2,298个SNPs，在∮进化谱系中仅出现过一次，并根据此构建了MSTree。
- 鼠疫传播路径〗分析
系统进化树分析结果表明※鼠疫起源于中国的青藏高原，其传播途径类似于古代丝绸』之路及茶马古道的线路，表明鼠疫的传播与人类活动密切相关。
案例二：结核分枝杆菌∮群体进化和耐药分析
Genome sequencing of 161 Mycobacterium tuberculosis isolates from China identifies genes and intergenic regions associated with drug resistance
期刊：Nature Genetics 发表时间：2013
材料与背景：
中国12个省份的161株结核＠ 分枝杆菌（其中44株敏感菌，94株多耐药菌，23株□ 泛耐药菌）
结果分析：
1. 通过本╳项研究，获得了我国临床耐药结核分枝杆菌中已知耐药相关基因的ξ突变情况，新发∮现了与结核分枝杆菌耐药性相关的72个编码基因和◆28个基因间隔区的突变。
2. 中国地区的结核病人主要受到lineage 2和lineage 4两系结核分枝杆菌的侵染，而且，其中95%的lineage 2结核分枝杆菌属于国际上比较关注的北京家族。北≡京家族的结核分枝杆菌一直被认为有更强的毒性和更容易产生耐药性。
DNA样本要求
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短读长测¤序 |
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样本类型 |
总量 |
浓度 |
完整性（胶图） |
纯度 |
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基因组DNA |
1 μg |
12.5 ng/μl |
主峰＞20Kb |
无蛋白，RNA/盐离子等ぷ污染，样本无色∑透明不粘稠 |
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长读长测♂序 |
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样本类型 |
总量 |
浓度 |
OD |
完整性（胶图） |
纯度 |
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基因组DNA-Pacbio平台 |
3.5 μg |
80 ng/μl |
OD260/280: 1.6-2.2 OD260/230: 1.6-2.5 |
无降解或轻微降解↘（主峰在40K附近且弥散『不低于20Kb） |
无蛋白，RNA/盐离子█等污染∏，样本无色透明、不粘稠 |
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基因组DNA-Nanopore平台 |
1 μg |
45 ng/μl |
OD260/280: 1.8-2.2 OD260/230: 1.8-2.2 |
无降解或轻微降解，基因组主』峰在30K附近或以▂上，且弥散不低于20K |
无蛋白，RNA/盐离子等污染，样本无色透明、不黏稠 |
Q1. 现在细菌完成图是否会限制基因组大小、GC含量、质粒情况，是否交▲付质粒信息？
A1：目前细菌完成图不再限「制基因组大小、GC含量、染色体数目及质粒情况；无需提前评估，都可以按照完成图的策略进行操作（基因组远大于10M的细菌仍需慎←重对待▽）；除了交付基因组组装结果以外〖还可以从组装结果中识别出质粒序列，并判断是否成环，挖掘质粒相∮关信息。
基因组大小︻在10M以内（包括10M或略高于10M）的细菌都可以选择以下策略：
PacBio：10-15Kb文库，1cell；DNBSEQ：200-300bp文库，1G测序数据。
Q2. 华大细菌完╲成图产品有哪些优势？
A2：华大细菌完成图目前是∑用PacBio Sequel II平台进行】测序，测序产量高，读长长，无样本间交叉污染。除了∞一般承诺的“1 contig, 0gap”，还可以进行√以下分析：
成环判定：明确判定细菌基因组序列数目︼及是否成环
零点确定：确定环状细菌基因组序列起始位点，便于序列比╳对分析
质粒识别：组装结果中识别出质粒序列，并判断是否成环，挖掘质粒相关信息←
甲基化分析』：基于三代测序进行甲基化位点分析及对应的motif序列分析
表1. 组装√结果示例
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样本名 |
染色体数目 |
Total length (bp) |
GC含量（%） |
ID: circular/linear: length |
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Ⅰ |
2 |
5,706,418 |
45.68 |
Chromosome_1:
circular:3383737 Chromosome_2: circular:2322681 |
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Ⅱ |
2 |
7,699,152 |
70.36 |
Chromosome_1:
linear:7685618 Plasmid_1: circular:
13534 |
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Ⅲ |
1 |
10,397,305 |
70.82 |
Chromosome_1: linear:10397305 |
