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ChIP-Seq
染色质免↙疫共沉淀（ChIP）是在体内环境中研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验々方法，广泛应用于组蛋白修饰、特定转录因子的基因调控作用等相关领域。随着新一代测序技术的发展和成熟，染色质免疫沉⌒淀实验与高通量测序的整合——Chromatin
Immunoprecipitation Sequencing （ChIP Sequencing ），可在∑ 全基因组范围对蛋白结合位点进行高效而准确的筛选ξ 与鉴定，同时也为研究的」深入开展打下基础。
采用特█异性抗体对目的蛋白进行免疫沉淀后，分离与其结合的基因组DNA片段，再通过高通量测序与数据分析，在全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点，并且可以基于『多个样品进行差异比较。
技术流程
技术优势
周期更短：交付快至25个工作日
低起始量：DNBSEQ平台起始量可低至5ng
准确性高：DNBSEQ与HiSeq平台一致性相关系数△高达0.99
关联分析：可定制 ChIP-Seq与RNA-Seq差异表◇达基因（DEGs）关联分析
研究内容
1) 数据过滤质控；
a) 数据产出统计
b) 质量、碱基比例分↓布图
2) ChIP 测序序列与参考基因组序列的比对（基于1）；
a) 比对结果①统计
b) 基因︼组测序深度累积分布
c) 基因测序深度分布
3) Peak 分析（基于2）；
a) Peak扫描
b) Peak长度分布
c) Peak深度分布
4) Peak注释（基于3）；
a) Peak在基因功能元件上的分布
b) Peak相∴关基因分析
c) Peak相关基因◢的GO功能显著〖性富集分析
d) Peak相关基因的◣〓Pathway功能ㄨ显著性富集分析
5) 鉴定样◣品间差异Peak（基于2,3）；
对两个样品进行差异分析，确定存在样品间差异修饰的区间。
6) 样品间差异Peak注释（基于5）；
a) 差异Peak的基因功☉能元件分布
b) 差异Peak相关基因分析
c) 差异Peak相关基因的GO功◥能显著性富集分析
d) 差异Peak相关基因的Pathway功能显著性〒富集分析
7) 免费提供UCSC genome browser 使用说明（基于2,3）。
定制化信息分析
可结合客户的需求，协商确定定制化信╱息分析内容（如甲基化与∴转录组关联分析等）。
案例一：DNBSEQ ChIP-Seq在乳腺癌转移研究中的应用[1]
案例描述: 乳腺癌是人类常见的一种恶性肿瘤，据统计，全球每年新发乳腺癌高达120万人，是女性第一高发的肿瘤，近年来我国的乳腺癌发病率明显〖增高，而乳腺癌转移是导致患者死亡的主要原因，乳腺癌转移的分子机理目前还不完全清楚，在以往的→研究中观察到FOXN3在其他恶性肿瘤中表达失调的现象，但FOXN3在恶性肿瘤（包括乳腺癌）发生中的作用及分子机理仍有待研究，它的功能又№需要哪些分子共同作用。
发表单位：北京大学医学部∑ ∏ 尚永丰院士
影响因子：12.784
研究技术：（DNBSEQ ChIP-Seq）染色质免疫共沉▼淀测序、（iRIP-Seq）RNA免疫共沉淀测序等。
研究成果：
揭示了FOXN3-NEAT1-SIN3A阻遏物复合体的存在方式；
全基因组范围内鉴定了FOXN3-NEAT1-SIN3A阻遏物复合体的☆目标基因；
FOXN3-NEAT1-SIN3A阻遏复合体促进乳腺癌细胞的EMT转化ξ和侵袭↙；
FOXN3-NEAT1-SIN3A阻遏物复合体促进乳▼腺癌的转移；
FOXN3和NEAT1在乳腺癌中上调，其高水平与较高的肿瘤分级和较差的存活率相关。
部分结果展示：
图1 ?A.FOXN3 iRIP-Seq显著富集lncRNA分析结果；B. iRIP-Seq结果qPCR验证结果； C.LncRNA表达芯片检测散点图
案例二：肝细胞中TCF7L2全基因组靶基因调〖控机制研究[2]
案例描述：TCF7L2在肝脏中代谢通路中具有重要作用，之前的研究发现ξ TCF7L2在成千上万个基因区域有富集，但具体哪一个才是重要的结合位点有待挖掘。
研究思路：
?
?图2 文章研究思路
研究结果：TCF7L2沉默后实时RNA-Seq检测3-96h有406个差异表达基◎因，进一】步结合ChIP-Seq peak相关系数PPS大于10的直接调控Gene有149个，确定TCF7L2参与九大通路调控，其中包括脂质，碳水化合物和氨基酸以及尿素代谢途径等。
图3 TCF7L2 peak proximity scores与DEGs表达差异值趋势图
图4 不同时期peak proximity scores与DEGs关系↓分布图
参考文献
[1]Yongfeng Shang,Yu Zhang,et al.The FOXN3-NEAT1-SIN3A repressor complex promotes progression of hormonally responsive breast cancer. J Clin Invest. 2017 Aug.
[2]Luke N., et al. (2014) The mechanisms of genome-wide target gene regulation by TCF7L2 in liver cells. Nucleic Acids Research, 2014, Vol. 42, No. 22 13647.
DNBSEQ ChIP-Seq平台及建库技术简介
1. 平台介绍
DNBSEQ平台已经广泛用于DNA、RNA测序，基于此平台不断有高分文章产出。DNBSEQ测序平台有五大关键的技术：DNB、Pattern array、cPAS、MDA-PE、sCMOS，保证了该平台测序的准确性。
与其他二代测序技术相【比较，DNB测序技术具有以下几个优势：
（1）DNB通过增加待测DNA的拷贝①数而增强了信号强度，从而提高测序准确度；
（2）不同于PCR指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积；
（3）DNB与芯片上活化位点的大小相同，每个位点只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相☉互干扰；
（4）阵列化测序◤芯片和DNB测序技术的结合，使得成像系统像素和测序芯片的面积得到最大化利用。
2. 建库技术
图1? DNBSEQ平台ChIP-Seq建库测序流程图
DNBSEQ ChIP-Seq数据展示
1. 与HiSeq测序平台一致性相关系⊙数高达0.99
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图2? DNBSEQ平台与HiSeq平台ChIP-Seq结果一致▆性评估
2. 测序ㄨ重复性高达0.98
? ? ? ? ? ?图3? DNBSEQ平台ChIP-Seq测序重复性评∴估? ? ? ? ? ? ? ?图4 HiSeq平台ChIP-Seq测序重复性评估
? ? ?3. 全面的信息分析，蛋白位点无处可逃
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?图5 peak在基因功能元件上的分布分析? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 图6 peak相关基因的GO功能显著性富集分析?
样品要求
样品类型：IP富集DNA样品，强烈建议同时送对应的Input DNA；
总量：≥ 10 ng ChIPed DNA（人类样本可以低〇至5ng）；
浓度：≥ 1 ng/μL；
纯度：OD260/280= 1.8 -2.0；
DNA片段大小：分布在100~500 bp范围，且主带明显。请提供DNA打断后的检测胶图以确定DNA片段大小是否符合要求，并请□ 附加一份详细的样品信息单并提供ChIP后的q-PCR验证结果；
执行周期
46个样本以下，25个工作日（DNBSEQ平台）
推荐数据
推荐数∏据量： 20M或40M clean reads。
Q1：DNBSEQ平台∑ 的测序原理是什么？
DNBSEQ采用优化的联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术，是行业领先的高通量测序平台之一。具体而言，首先DNA分子锚和荧光探针在纳米球上进行聚合，随后高分辨率¤成像系统对光信号进行采集，光信号经过数字化处理后即可获得待测序列。其中，DNB通过线性扩增增强信号，降低单拷↙贝的错误率。此外，DNB大小与芯片上活性位点的大小相匹配，每个位点结合一个DNA纳米球，在保证测序精度的情况ζ下提高了测序芯片的利用效率。
Q2：DNBSEQ ChIP-Seq产品优势是什么？
a)?????
准确性高：高深度Peaks与HiSeq平台一致性高〖达到100%
b)????? 起始量低：样品起始量低至5ng
c)????? 周期更短：交付快至25个工作日
d)????? 性价比高：相同的测序质量，价格更优惠
e)????? 关联分析：ChIP-Seq与RNA-Seq差异表达基因（DEGs）关联分析
Q3：对样本起始量有没有要求？
建库起始♀量为5ng，建议ChIP-ed DNA≥ 20ng，低于5ng也可以做，之前有做过无々浓度样本成功的案例，但这类项目只能客户自己承担建库风险。
Q4：测序策略是◣什么？
SE50
Q5： ChIP-Seq的对照中input和IgG有什么不同吗？
Input对照：在进行免疫沉淀前，需要取一部※分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，不加抗体做富集，但是需要♀与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可㊣以根据Input中【的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例》换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
阴性对照：用普通的IgG做为抗体（目的蛋白抗体宿主的IgG或血清）。理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阴性对」照，但是由于非特异结合，或者实←验过程中◤，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带，如果非常明显，那就证明实验过程有待改进。
Q6：推荐多少数据◇量？能否接不同数据量的项目？
DNBSEQ ChIP-Seq推荐20M clean reads/样本，其他类型╱数据量也可提供。
Q7：N-ChIP和X-ChIP的区别是什么↑？
N-ChIP基于核酸内切酶MNase酶切，切割核小体且作用温和，较适用于组蛋白修饰研究；X-ChIP基于甲醛固定，超声打断，适用于大多数蛋〒白-DNA相互作用⌒研究。
Q8：样品制备过程是否需要PCR扩增？PCR扩增后是否会影响最后的结果？
基于第二代测序平台的ChIP-Seq在样品制备过程中需要进行PCR，但是只需要非常∩少的反应次数，由于PCR引起的□ 偏向性非常小。另外，在测序结果出来后，针对reads的比对结果∏，通过信息分析手段可以去除duplication的影响。我们的所有信息分析结果都是在去除duplication之后进行生物学意义挖掘的。根据我们的经◆验，如果您送的样品是直接ChIP富集的DNA，在我们★的样品制备后出现duplication的reads比例◎不会超过全部reads产量的5%。如果您送的样品在ChIP富集后有做过PCR扩增，那么这一步的PCR对结果的duplication影响非常严重。
Q9：哪些↘因素会影响ChIP-Seq的结果？
抗体的质量∮与特异性、需要富集∏的目标区域在基因组上的比例、ChIP的实验▆操作、DNA片段长度范围等都会影响ChIP-Seq的结果。
